Genetik tanı merkezlerinde genetik hastalıklarının tanısı amacıyla hastalardan elde edilen örnekler hastalık ön tanısına göre bir dizi işlem sonucunda incelenerek genetik test sonuçları raporlandırılmaktadır. Bu raporlandırmanın düzgün bir şekilde yapılabilmesi için hastadan elde edilen örneğin laboratuvar numune kabul ve red kriterlerine (Tablo 1) uygun bir şekilde alınarak laboratuvara ulaştırılması birinci temel şartı oluşturmaktadır.
Tablo 1: Genetik testler için uygun numune koşulları
NUMUNE | TÜP/KAP | MİKTAR | SAKLAMA | UYGUNSUZ |
Periferik Kan örneği | Sitogenetik testler için Heparinli (yeşil kapaklı) tüp, moleküler testler için EDTA’lı (mor kapaklı) tüp | 4-5 ml | 2-8 °C | Dondurulmuş, hemolize uğramış, pıhtılaşmış, eksik miktarda, farklı tüpte veya transportu yanlış sıcaklıkta yapılan örnekler |
Kemik İliği örneği | 2-3 ml | 2-8 °C | ||
Fetal Kan örneği (Kordon) | 2-3 ml | 2-8 °C | ||
Koryon villus örneği | Steril boş kap | 20-30 mg | 18-24 °C | |
Amniyon sıvısı | Steril boş kap | 20 ml | 18-24 °C | Contalı enjektör, kanlı sıvı |
Abort materyali | Steril boş kap | 1-2 cm³ doku | 18-24 °C | Formaldehit veya alkol içinde olan örnekler |
Biyopsi | Steril boş kap | 1 cm³ doku | 18-24 °C |
Genetik laboratuvarına gelen örnekler çalışılacak testin özelliklerine göre farklı departmanlarda farklı tekniklerle incelenmeye alınırlar:
- Sitogenetik laboratuvarlarında kromozom analizine dayalı testler çalışılmaktadır.
Kemik iliği, deri fibroblastları, plasenta, amniyositler gibi bölünme özelliği olan çekirdekli canlı hücreler kromozomların elde edilmesi için uygun örneklerdir. Standart bir postnatal hastadan kromozom analizi için kullanılan hücreler periferik kandaki T lenfositlerdir. Örnekler 72 saatlik hücre kültürüne alınarak çoğaltılır ve çekirdekteki kromozomların bölünme esnasında dizili olduğu metafaz evresinde yakalanması için 70. saat sonunda kolşişin kullanılarak kültür sonucunda harvest aşamasında toplanır. Yıkama, yayma ve yaşlandırma işlemlerinden sonra boyanarak heterokromatin ve ökromatin bölgelerin bantlama işlemi yapılır. En sık Giemsa veya Leishman boya kulanılarak G-banding tekniği uygulanır. Sentromerlere özgü C-bantlama ve akrosentrik kromozomların satellit bölgelerine özgü NOR boyama yöntemleri de kullanılmaktadır. Preperasyon işleminden sonra kromozomlar büyüklüklerine ve özelliklerine göre dizilerek en az 450-550 bant çözünürlüğünde karyotipleme yapılır. Bu yöntemle en düşük 8-10 megabazlık değişiklikleri saptamak mümkündür. Ardından sayısal ve yapısal anomaliler saptanmış ise endikasyonuna göre raporlandırılır.
Başlıca kromozom analizi endikasyonları; büyüme gelişme geriliği, konjenital malformasyonlar, dismorfik bebek, ölü doğum, tekrarlayan gebelik kaybı, infertilite, entelektüel yetersizlik, fetal anomali riski, 35 yaş üstü gebelikler, ailde bilinen kromozom anomalisi veya translokasyon taşıyıcılığı, spesifik kromozomal hastalık, kanserlerdir.
- Moleküler sitogenetik laboratuvarında FISH (Floresan in situ hibridizasyon) prensibine dayalı testler çalışılmaktadır.
Kromozom analizi ile saptanamayan daha küçük delesyonlar ve duplikasyonlar bu yöntemle tanı alabilmektedir. FISH çalışmalarında amaç hedef bölgenin işaretlenerek kopya sayısının saptanmasıdır. Hedef nükleik asit bölgesi lokus spesifik problar veya tekrarlayan dizi probları kullanılarak hibridize edilir ve floresan mikroskop ile görüntülenir.
Başlıca FISH endikasyonları; mikrodelesyon sendromlarının (Di George, Wolf-Hirschhorn, Williams sendromları) tanısı, hematolojik kanserlerin (Akut Myeloblastik Lösemi, Akut Lenfoblastik Lösemi, Kronik Lenfositik Lösemi, Kronik Myeloid Lösemi, Myelodisplastik Sendrom, Multiple Myelom) tanısı, spesifik kromozomun (13, 18, 21, X, Y) veya kromozom bölgesinin (subtelomerik, alfa-satellite) tanınması, tüm kromozomun tanınması (spektral karyotipleme) şeklindedir.
- Mikroarray analizi komperatif genom hibridasyonu (CGH) temeline dayanan referans genom dizisi ile hastanın genomunu karşılaştırarak yüksek çözünürlüklü tarayıcılar sayesinde birkaç kilobaza kadar uzunluklardaki delesyon ve duplikasyonları tespit edebilen genetik tanı tekniğidir.
Mikroarray çalışması için DNA izole edildikten sonra önce endonükleaz enzimlerle kesilir, primerler ve ligaz enzimleri kullanılarak PCR ile çoğaltılır. Ardından bir çip aracılığıyla hibiridize edilir, yıkama ve boyama aşamalarından sonra tarayıcı ile okunduktan sonra kopya sayısı değişiklikleri (CNV) tespit edilerek analiz edilir.
Mikroarray analizi için endikasyonlar; multiple konjenital anomaliler, entelektüel yetersizlik, büyüme gelişme geriliği, otizm spektrum bozuklukları, kromozomal anomalilerin tam lokalizasyonu ve içerdiği genlerin tespiti şeklindedir. Kopya sayısında değişikliğinin olmadığı dengeli translokasyonlar ve düşük oranlı mozaik durumlar mikroarray yönteminin kısıtlılıklarıdır.
- Moleküler Genetik laboratuvarında DNA ve RNA temelli testler çalışılmaktadır.
Yeterli konsantrasyon ve saflıkta DNA/RNA izolasyonu moleküler genetik çalışmalar için ilk basamaktır. Ardından polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hedef gen bölgesinin özelliğine göre uygun olan primerler ve enzimler kullanılarak sırasıyla denatürasyon, bağlanma, uzama aşamalarıyla thermal cycler cihazında çoğaltılması gerekmektedir. PCR yöntemiyle amplifiye edilen DNA, istenilen hedef gen bölgesinin çoğaltıldığını kontrol etmek amacıyla agaroz jel elektroforezi ile görüntülendikten sonra kullanılacak yönteme göre farklı kit ve cihazlar ile işleme alınır.
DNA dizileme metodu klasik Sanger dizi analizi yönteminin geliştirilmesi ile yüksek güvenilirlikte okuma yapabilmektedir. Tek gen hastalıklarında klinik olarak ön tanısı olan genetik hastalığın geninin/genlerinin kodlama yapan ekzonları dizilenerek herhangi bir anlamlı nokta mutasyonu olup olmadığına bakılmaktadır.
Yeni nesil dizi (NGS) analizi son yıllarda daha fazla hasta kapasitesi ile çalışan bir yöntem olarak kullanımını artırmaktadır. Pahalı olmasına rağmen Sanger metoduna göre en önemli avantajı aynı anda milyonlarca dizilemenin yapılabilmesidir.
NGS teknolojisiyle moleküler genetik tanı alanında spesifik testler de uygulamaya geçmektedir. Tüm ekzom dizileme (WES), klinik ekzom dizileme (CES) ve tüm genom dizileme (WGS) ile yoğun biyoinformatik araştırmalar ve klinik irdelemeler sonucunda tanı koyulamayan hastalara genetik tanı imkânı sunulabilmektedir.
Multiple ligasyon bağımlı prob amplifikasyonu (MLPA) tekniği kullanılarak, tek gen hastalıklarında dizi analizi ile tespit edilemeyen tek nükleotid düzeyinden daha büyük ekzon bölgeleri boyunca var olan delesyon ve duplikasyonlar tespit edilebilmektedir. Spinal musküler atrofi (SMN1/SMN2), Duchenne musküler distrofi (DMD) gibi hastalıklarda altın standart yöntem iken dizi analizinde mutasyon tespit edilemeyen herediter meme ve over kanseri (BRCA1 ve BRCA2), kistik fibrozis (CFTR) gibi hastalıklar için de tanıda değerlendirilmesi gereken bir yöntemdir. Ayrıca metilasyon spesifik yöntemlerle tanı koyulan Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi gibi sendromlarda da temel tanı testidir.
Real-Time Revers Transkriptaz PCR metodu ile kantitatif olarak reaksiyon ürünlerinin birikimi eş zamanlı olarak görüntülenebilmektedir. Geniş dinamik aralık, yüksek doğruluk ve mutlak miktar tayininin yapılabilmesi gibi özellikler sayesinde gen ekspresyonunu belirleyebilmesi bu yöntemin klinikte hematolojik malignensilerin tanı, takip ve prognozunda kullanım imkânını sağlamaktadır.
Likit biyopsi yöntemi hamatolojik malignensilerin tanı ve takibinde kullanılan özellikli bir test olarak son yıllarda yerini almaktadır. Likit biyopsi yöntemi ile biyopsi almanın mümkün olmadığı solid tümörlerde erken evrelerde dahi dolaşımdaki tümör hücresinin DNA’sından mutasyon tespiti ve mutasyon yükü saptamak mümkün hale gelmiştir.
- Prenatal Genetik Tanı uygulamaları intrauterin dönemde fetal tarama testlerinde anomali riski saptanması durumunda, ultrasonografik veya klinik bir antitenin tespitinde veya bilinen bir aile öyküsünün araştırılması için başvurulan genetik tanı yöntemidir.
Amniyosentez, kordosentez veya koryon villus biyopsi örnekleri uygun haftalarda ve uygun koşullarda alındıktan sonra kromozom analizi için sitogenetik, tek gen hastalıkları için moleküler genetik ve mikrodelesyon sendromları için de moleküler sitogenetik çalışmalar gerçekleştirilmektedir.
Noninvaziv Prenatal Tanı (NIPT) uygulamaları bebeğe invaziv girişim yapılmadan annenin kanından bebeğe ait fetal DNA parçalarının tespiti ile bebeğe ait kromozomal bir hata olup olmadığını araştıran bir yöntem olarak son yıllarda prenatal testlere alternatif şekilde sunulmaktadır. Klinik uygulamalarda ikili tarama testinde 1/100 ile 1/1000 arasında saptanan trizomi riskleri için invaziv tanı öncesi önerilmektedir. Fetal fraksiyon oranının düşük olması durumunda testin tekrarı uygundur. Pozitif vakalarda invaziv bir tanı yöntemi ile doğrulanması gerekmektedir. Testin hassasiyeti yüksek olduğu için güvenilirlik sınırları istenilen seviyeye ulaşsa da bir tanı testi yerine bir tarama testi olarak değerlendirilmelidir.
- Preimplantasyon Genetik Tanı (PGD) yardımcı üreme tekniklerinin devreye girmesi ile prenatal tanının alternatifi olarak popülerlik kazanan bir genetik tanı yöntemi olmuştur.
Embriyoda anöploidi taraması, tek gen hastalıkları tanısı, HLA uyumlu kardeş için IVF öncesi PGD teknikleri kullanılmaktadır.
- Adli Tıp uygulamalarında genetik testler kısa tekrar dizilerinin (STR) polimorfizmleri kullanılarak, kimliklendirme (babalık testi) ve bulunan örneğin kime ait olduğunun belirlenmesi amacıyla Adli Tıp kurumlarında kullanılmaktadır.
DNA profil belirleme (DNA bankalama) işlemleri de STR analizi ile ovum prezervasyonu öncesinde, kök hücre nakli sonrasında ve organ transplantasyonu sonrasında uyumluluk belirlemede, prenatal örneklerde maternal kontaminasyon olup olmadığı tespitinde genetik tanı merkezlerinde yapılmaktadır.
Uzm. Dr. Ömer Faruk Karaçorlu
Tıbbi Genetik Uzman Hekimi
2024